H Μαίρη, βασίλισσα της Σκωτίας, ήταν μοναδική κόρη και νόμιμο παιδί του Ιακώβου ‘Ε της Σκωτίας και της Μαρίας του Γκιζ. Γεννήθηκε στις 8 Δεκεμβρίου 1542 στα ανάκτορα του Λινλίθγκοου. Έχει αναφερθεί πως γεννήθηκε πρόωρα και πως ήταν το μοναδικό νόμιμο παιδί του βασιλικού ζεύγους, το οποίο κατάφερε να επιζήσει.
Έξι μέρες μετά τη γέννηση της, στις 14 Δεκεμβρίου 1542, στέφθηκε βασίλισσα καθώς ο πατέρας πέθανε πρόωρα. Το πως πέθανε, δεν έχει διευκρινιστεί ακριβώς. Λέγεται πως πέθανε είτε από κάποια νευρική κρίση είτε από χολέρα.
Η Μαίρη βαπτίστηκε στην Εκκλησία του Αγίου Μιχαήλ απευθείας μετά τη γέννηση της. Εξαιτίας της μικρής της ηλικίας, θα έπρεπε να κυβερνήσει με κάποιον αντιβασιλέα. Οι βασικοί διεκδικητές ήταν ο καθολικός καρδινάλιος Ντέηβιντ Μπήτον και ο προτεστάντης Τζέημς Χάμιλτον. Με την υποστήριξη των φίλων και των συγγενών του ανέλαβε εν τέλη την αντιβασιλεία ο προτεστάντης Χάμιλτον.
Σε ηλικία πέντε ετών η Μαίρη, μετά τη σύναψη της γαλλικής συνθήκης, στάλθηκε για τα επόμενα 13 χρόνια στη γαλλική αυλή. Είχε χαρακτηριστεί ως μια όμορφη και έξυπνη κοπέλα, είχε μια αρκετά προνομιακή παιδική ηλικία στη γαλλική Αυλή και παρόλα αυτά, δεν είχε ιδιαίτερα καλές σχέσεις με τη βασίλισσα Αικατερίνη των Μεδίκων. Η Μαίρη είχε έφεση στις ξένες γλώσσες καθώς γνώριζε ελληνικά, γαλλικά, λατινικά, ιταλικά και ισπανικά. Εκτός από αυτή την αγάπη της γνώριζε ποίηση, ιππασία και μαγειρική.
Στις 4 Απριλίου 1558, η Μαίρη υπέγραψε μια μυστική συνθήκη η οποία ανάφερε πως σε περίπτωση όπου η ίδια θα πέθαινε χωρίς απογόνους, τα δικαιώματα της στους θρόνους της Σκωτίας και της Αγγλίας θα περνούσαν στο γαλλικό στέμμα. Είκοσι μέρες μετά την υπογραφή αυτής της συνθήκης, παντρεύτηκε τον Φραγκίσκο, γιο του Ερρίκου και της Αικατερίνης (βασιλείς της Γαλλίας) και έτσι έγινε η επόμενη βασίλισσα.
Στις 10 Ιουλίου 1559, ο Ερρίκος Β’, πέθανε από τα τραύματα του μετά από μια κονταρομαχία. Τότε, τον διαδέχθηκε ο γιος του Φραγκίσκος και σύζυγος του Μαίρη Στιούαρτ.
Στη Σκωτία είχε ανέβει η δύναμη των προτεσταντών εξαιτίας της μητέρας της Μαίρης, Μαρία του Γκιζ. Εκείνη πέθανε στις 11 Ιουνίου 1560 με αποτέλεσμα οι σχέσεις ανάμεσα σε Γαλλία και Σκωτία να περάσουν κρίση. Λίγες μέρες αργότερα, στις 6 Ιουλίου 1560 υπογράφηκε η συνθήκη του Εδιμβούργου από τους απεσταλμένους της Μαρίας, η οποία συνθήκη ανάφερε πως θα έπρεπε Αγγλία και Γαλλία να αποσύρουν τα στρατεύματα τους από την Σκωτία και η Γαλλία θα έπρεπε να αναγνωρίσει τα δικαιώματα της Ελισάβετ στην Αγγλία. Όταν η μητέρα της Μαίρης πέθανε, εκείνη βρισκόταν στη Γαλλία και μέσα στη περίοδο θρήνου όπου βίωνε, αρνήθηκε να επιβεβαιώσει τη συνθήκη.
Η βασιλεία του Φραγκίσκου και της Μαίρης, είχε ημερομηνία λήξης. Λίγα χρόνια μετά, ο Φραγκίσκος πέθανε από μια λοίμωξη που είχε στο αυτί και είχε εξελιχθεί σε απόστημα εγκεφάλου. Η Μαίρη βίωσε ακόμα ένα θάνατο που τη συνέτριψε. Επέστρεψε στη Σκωτία στις 19 Αυγούστου 1561. Εξαιτίας της τόσο μεγάλης απουσία της από τη γενέτειρα της, δεν γνώριζε τις πολιτικές καταστάσεις όπου είχαν λάβει χώρα. Στη Σκωτία γινόντουσαν συνεχείς συγκρούσεις ανάμεσα σε καθολικούς και προτεστάντες. Η Μαίρη ήταν καθολική και αυτό έκαναν τους προτεστάντες, ακόμα και τη Βασίλισσα Ελισάβετ της Αγγλίας, να τη βλέπουν με καχυποψία. Ο νόθος ετεροθαλής αδελφός της Τζέιμς Στιούαρτ, 1ος Κόμης του Μάρεϋ, ήταν αρχηγός των προτεσταντών. Η Μαίρη τον κατηγόρησε για προδοσία, όμως εκείνος αθωώθηκε και ελευθερώθηκε.
Μετά τη κρίση των Καθολικών η Μαίρη αναγκάστηκε να δεχτεί το νέο προτεσταντικό συμβούλιο και κράτησε τον αδελφό της Τζέιμς ως κύριο σύμβουλο αυτής της ομάδας. Το συμβούλιο διορίστηκε στις 6 Σεπτεμβρίου 1561 με 16 άντρες στο σύνολό τους προτεστάντες και με μόνο τέσσερις συμβούλους καθολικούς.